ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ, ПЦР
(Polymerase chain reaction, PCR)
- диагностический прием, позволяющий определять специфические (вирусные) нуклеиновые кислоты или их фрагменты с высокой степенью разрешения, разработан и впервые применен К. Миллис с соавторами в 1985—87 гг. В основе метода лежит многоцикловой процесс, напоминающий естественную репликацию нуклеиновой кислоты, причем, каждый цикл состоит из трех последовательных этапов. Первый этап состоит в денатурации искомой нуклеиновой кислоты, достигаемой повышением температуры до 70 — 80°С, после чего нуклеиновая кислота присутствует в растворе в виде отдельных цепей; если искомой нуклеиновой кислотой является РНК, то она предварительно переводится в форму к ДНК методом обратной транскрипции. На втором этапе к определенному участку каждой из противоположных цепей присоединяются т.н. праймеры — короткие олигонуклеотиды, комплементарные известным нуклеотидным последовательностям; для осуществления этого присоединения температура среды понижается до 37 — 40°С. На завершающем третьем этапе происходит синтез новых цепей (амплификация нуклеиновой кислоты) при участии фермента — термостабильной ДНК полимеразы, поскольку этот этап, как и первый, протекает при высокой температуре. Через три цикла устанавливается стабильная амплификация фрагмента, соответствующего нуклеотидной последовательности между двумя праймерами. Обычно хорошие результаты дает амплификация фрагмента протяженностью от 400 до 2000 нуклеотидов. Конечная продукция составляет 2^n копий фрагмента, где n — число циклов. Специальный прибор (сайклер) позволяет быстро менять температуру реагирующей смеси. В этих условиях постоянно удается получать концентрацию фрагмента, превышающую исходную в 106 — 107раз. В дальнейшем специфические нуклеотидные последовательности синтезированного анализируются методом блоттинга, предложенного Е.М. Соутерном; они могут быть использованы также для клонирования и секвенирования гена.
ПЦР отличается высокой чувствительностью и специфичностью в обнаружении нуклеиновых кислот вирусов и нашла применение в работе со всеми известными вирусами гепатитов человека, правда, пока на уровне специализированных научно-исследовательских лабораторий.
